一、前言

人感染高致病性禽流感(以下簡稱“人禽流感”)是人畜共患的新發傳染病,病死率高,嚴重威脅公眾健康與生命安全。同時,也對國家的經濟與社會發展帶來負面影響。由於人禽流感具有演變成為人與人之間傳播並且引發流感大流行的潛在危險,因此,加強對人禽流感的防控和醫學研究十分必要。為盡快查明疑似人禽流感病例的病因、明確診斷和指導臨床救治,進一步規範人禽流感死亡病例的屍體解剖查驗工作,依據《中華人民共和國傳染病防治法》、《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《醫療廢棄物管理條例》和《傳染病病人或疑似傳染病病人屍體解剖查驗規定》的有關規定,結合人禽流感的特點,特制定本技術規範。

二、解剖檢驗病例的選擇及屍體保存方法

解剖屍體的選擇:所有懷疑人禽流感病例死亡後,為查明病因,應依法對屍體進行解剖查驗(以下簡稱“屍檢”)。明確診斷為人禽流感的病人死亡後,需要對屍體解剖開展相關研究時,應先征得病人家屬同意後,方可進行。

屍檢工作應在判定病例死亡後盡快進行,通常情況下應在病例死亡48小時內進行。在屍檢前,屍體應保存在0-4℃的環境—2—中;如果不能達到上述要求,或不能進行全面屍檢,應至少用針刺法取得小的標本,保存在0-4℃的環境中。針刺取材的部位,至少應包括左右肺髒的各葉,氣管粘膜和喉粘膜。

三、屍檢工作人員的要求

屍檢工作應由具有感染性生物樣本處理經驗並且熟悉人禽流感病理改變的病理醫生和技術人員進行。直接接觸屍體的操作人員一般應由5人構成,其中醫生3人(主檢、副檢、取樣人員各1人),技術員2人(開顱、記錄人員各1人)。參加屍檢工作的病理醫生和技術人員必須接受過嚴格的生物安全培訓。

四、解剖裝備

操作者應配備具有良好防護功能的防護設備,所有的防護服、設備和器械及可能受到汙染的物品都應通過化學或高壓滅菌的方式進行消毒處理。

自備物品:包括解剖器械、稱量用具、個人防護用品、防滲漏屍體袋以及檢材存放容器等。

委托單位(屍解當地單位)准備物品:0.5%的84消毒液(用於地面、牆面、器皿及門窗表面的消毒)、10%福爾馬林(用於固定標本)及相應的盛放容器等。

五、屍檢地點的選擇及應當遵循的生物安全規範

雖然目前尚不能確定禽流感病毒能否在人與人之間傳播,但在屍檢工作中,病毒在屍體與人之間傳播的可能性和危險性很大。鑒於屍檢工作對於病理醫生和技術人員具有一定的危險性,且存在對周圍環境造成汙染的潛在威脅,嚴格禁止在不具備如下安全操作條件的地點進行屍檢。

(一)在人口密集的地區和城市,屍檢工作應在能維持足夠負壓和具備高壓滅菌裝置的生物安全P2+或P3級屍體解剖室中進行,操作環境的氣流應當能夠防止感染性物質形成的氣溶膠或飛沫感染操作者和汙染環境。

(二)在沒有P2+或P3解剖室的條件下,屍檢應在為傳染病屍檢特制的一次性安全防護袋中進行,防護袋將被感染的屍體與屍檢人員和周圍環境完全隔離,屍體存放於密封的透明屍檢袋中,屍檢人員在屍檢袋外通過安全套袖和手套對透明袋內的屍體進行操作。組織標本通過雙門互鎖的安全門傳遞,屍體袋在用完後與屍體一起進行火化或深埋,從而避免被感染的屍體體液和組織粉末與人接觸,保護屍檢人員和環境安全。如果沒有條件火化,屍體應該及時焚燒,然後深埋(地表面2米以下)。

(三)如果上述條件不具備,則至少應當在相對空曠和通風換氣充足的空間,在配備有效防護和滅菌設備的條件下開展屍檢。應嚴格按照下列的區域劃分和安全規程操作進行。

(四)現場的區域劃分規則。

1.屍檢現場應劃分為汙染區、半汙染區與清潔區,其中汙染區為解剖操作間,半汙染區為解剖人員個人清洗及消毒場所。

2.根據現場建築物布局特點及周圍環境,合理劃分汙染區、半汙染區與清潔區,在半汙染區外圍3米處設立安全線,在屍檢工作完成並實施環境消毒以前,嚴禁人員通行與進入。

3.汙染區、半汙染區及清潔區要盡可能隔絕。如果現場條件不允許,應盡可能隔絕汙染區與半汙染區,且將半汙染區盡量擴大並設置在空曠區域。

4.在人員及建築物密集地區進行屍檢,應選擇封閉性較好的房間作為解剖操作間,並用膠帶、塑料布等盡可能密閉門窗,以減少對周圍環境的汙染。

5.在相對空曠環境下,開放式解剖環境下,應選擇在建築物較少,通風良好的區域,並盡可能擴大安全線的範圍,使環境中的汙染成分盡快稀釋。

六、屍檢環境消毒

(一)屍檢人員進入解剖間後,即封閉門窗,隔絕汙染區與半汙染區。

(二)屍檢過程中,記錄人員隨時用0.5%的84消毒液噴灑地面與牆面,以保持汙染區環境中消毒液的濃度。

(三)屍檢完成後,需對解剖間進行徹底的噴灑消毒。屍體袋、解剖台及地面需重點消毒。

(四)屍檢完成後,由疾病預防控制專業人員按照有關規定進行環境消毒。

七、屍檢個人防護

(一)屍檢人員在清潔區更換消毒手術衣、隔離服及手術手套後方可進入半汙染區。

(二)在半汙染區准備好個人清洗和消毒所用器具及消毒液,並整理清點解剖所用物品。

(三)在半汙染區穿上隔絕式防化服、防毒面具及手套後,帶上解剖間所用物品進入汙染區。

(四)屍檢過程中應分工明確、操作規範,器械擺放規整。避免銳器(刀、剪等)和骨斷端引起皮膚損傷。一旦發生手套破損,必須消毒,更換新手套。謹慎操作,避免將屍體的血液、體液、尿液和糞便濺到解剖台外和解剖者的衣服上。

(五)屍檢完畢,在解剖操作間進行隔絕式防化服及戴橡皮手套的初次消毒處理。然後,在半汙染區洗刷與噴淋結合的方式對防化服、面具及手套表面進行徹底消毒。依次脫掉隔絕式防毒衣手套和面具,並浸泡在預先准備好的消毒桶中。

八、屍檢操作一般原則

屍檢工作應遵循人體系統解剖的常規步驟,所有的器官均應當進行大體檢查和顯微鏡下檢查,所有的大體檢查均應保存高質量的圖像和視頻記錄。

(一)采用全髒器整體取出法或髒器逐個取出法,開顱取腦,必要時取脊髓。

(二)系統、全面的對各髒器進行肉眼檢查。

(三)各髒器按照屍體解剖規程逐一進行檢查、照相,並記錄檢查結果。

九、解剖查驗操作及病變檢查程序

屍體平躺在解剖台上,面朝上,基本步驟:

(一)一般檢查:身長、體重、性別等。

(二)體表檢查:皮膚黃染及出血情況,瞳孔大小、形狀,口、眼、耳、鼻分泌物,氣管位置,頸部鎖骨上淋巴結情況,四肢畸形與缺血情況,外生殖器情況,所有醫療過程中的遺留改變(切口、插管等)。

(三)體腔檢查:

1.檢查皮下脂肪情況及異常所見。胸膜腔負壓檢查。

2.T字型切口,離斷肋骨分離胸鎖關節取下胸骨柄及部分肋骨暴露胸腔。

3.離斷舌下肌群,切斷軟腭,分離鎖骨下軟組織,遊離上端。

4.檢查咽部並取分泌物及組織。縱隔髒器、注意有無胸腺殘留。雙肺、肺門淋巴結、胸膜及胸水情況。剪開氣管,切開肺髒並檢查、稱重,檢查淋巴結情況。

5.心髒檢查應包括4部位的心肌、血管和心內膜。Y字型剪開心包,檢查心髒表面、沿血流方向打開各心腔及血管,測量瓣膜、肌層厚度。以俯側面從髂動脈分支向上剪開主動脈及分支並檢查。

6.切開腹膜腔檢查髒器位置,腹水情況及性質,各髒器表面改變。

7.剪開食管達十二指腸下端,擠壓膽囊,檢查膽道通暢否。取下肝髒並檢查。切開胰腺檢查脾靜脈,取下脾髒並檢查。

8.鈍性分離後腹膜,將膀胱、直腸、子宮下端離斷(下界依男性前列腺、女性宮頸)。切斷雙側橫隔達錐體附著處。離斷後胸膜。將所有內髒取出。推擠髂動脈,注意血栓情況。

9.剝離腎髒、輸尿管達膀胱,檢查腎表面並切開檢查。

10.以俯側面放置於檢查台,取下雙側腎上腺。

11.檢查全部腸管,膀胱,尿道。

12.檢查女性子宮及附件,男性睾丸。

13.可能的情況下取眼球。

14.顱腔檢查:常規切皮及開顱,檢查腦膜、腦重量、表面、枕骨大孔。

(四)髒器檢查:取材和檢查應包括下列器官系統:

1.呼吸系統:包括鼻腔和口腔粘膜、咽喉部、氣管、支氣管和細支氣管,所有的肺葉。

2.消化道系統:包括食道、胃、小腸和大腸各個節段以及闌尾,肝髒和膽囊。

3.免疫系統:包括脾、淋巴結(特別是位於肺和消化道部位及其周圍的淋巴結和胸腺。

4.中樞神經系統:包括大腦主要部位,小腦和脊髓的主要成分。

5.心血管系統:包括心髒的不同部分和主要的血管。

6.內分泌系統:包括腎上腺、胰腺、甲狀腺、甲狀旁腺和垂體。

7.泌尿系統:包括腎髒、輸尿管、膀胱和尿道。

8.生殖系統:睾丸、附睾、輸精管、前列腺、陰莖、卵巢、輸卵管、子宮、宮頸和陰道。

9.骨髓。

10.眼。

11.內耳。

12.任何可能發生病理改變及隱形感染的部位,包括皮膚、肌肉、肌腱和粘膜等。

(五)其他:胎盤及胎兒。

十、屍檢標本的采集與留取

(一)首先采集各器官、組織的低溫冷凍保存和電鏡檢查標本。然後切取常規石蠟包埋標本,按每一塊組織編號,病變區域多取材。

(二)所有分管保存的標本(冷凍標本與電鏡標本),必需由解剖者用手術包中的無菌器械取材,放入預先放置的密封冷凍管內,並標注采集時間與部位,每一采集部位需更換消毒器械,盡量避免取材過程的汙染。組織標本應進行詳細記錄,組織應放置在塑料瓶中。所有裝組織的瓶皿應有清楚的標記,裝標本的瓶皿應保持清潔不被汙染,擰緊蓋子後液體不會溢出。這些容器應放在另一個清潔的密封容器中進行運輸。溫度應保持在0-10℃之內,應按生物安全方面的有關規定進行。

(三)標本處理。

1.新鮮組織:切成1.5×1.5×1.5cm³大小組織塊存放於帶螺口的塑料瓶內,標記及凍存。凍存在-70℃低溫冰箱或液氮中。

2.提取蛋白質、DNA和RNA(建議使用“RNA　Later”液體保存)。

3.電鏡組織:取切成0.3×0.3×0.3cm³直徑大小組織存放3%戊二醛固定液中。

4.光鏡組織:切取3×3×3cm³大小組織,存放於10%的福爾馬林緩沖固定液中。固定液的量應至少4-10倍於被固定組織的體積。保存標本的容器外壁消毒後按照相關的規定進行運輸。電、光鏡組織在固定液中固定3-24小時後,於緩沖液或固定液中4℃保存。

十一、解剖器械及標本處置

(一)解剖器械需要先用消毒液擦洗表面後,再浸泡入含有消毒液的密封容器中。

(二)盛放冷凍組織、電鏡標本及石蠟標本的冷凍管等容器表面需要用消毒液清洗後再浸泡入含有消毒液的密封容器中。

(三)所有帶出解剖間的物品(屍體、解剖器械、福爾馬林固定標本、冷凍標本等)必需對其表面或封裝容器表面進行徹底消毒。

(四)所有需要進入清潔區的標本(福爾馬林固定標本、冷凍標本等)必需在半汙染區對封裝容器表面進行再次消毒與封裝。

(五)需要反複使用的物品(解剖器械、隔絕式防化服、頭盔等)需要在半汙染區用0.1%的84消毒液浸泡24-36小時以上,再用清水漂洗3遍,擦拭幹淨後裝箱運走。

(六)解剖所取檢材(冷凍組織、電鏡標本、福爾馬林固定標本等)按相關規定送達有相應資質的單位檢查與留存,實施完善的簽收制度。

(七)所有操作人員在完成屍檢後都應進行徹底的淋浴消毒。

(八)所有操作人員在屍檢結束後均應進行醫學觀察,出現高熱、咳嗽等不適症狀的人員應隔離觀察7天,直至各種症狀消失方可接觸醫學觀察。

(九)屍檢結束後,屍體的剩餘部分應盡快焚化,並對工作環境徹底消毒。

十二、屍檢廢棄物及汙水的處理

(一)屍檢在防滲漏透明安全屍檢袋中進行,避免廢棄液體及汙水排放對環境造成汙染。

(二)屍體的血液、體腔積液等液體廢棄物需用脫脂棉吸幹,嚴禁直接排入下水道。

(三)屍檢廢棄物(破碎組織、紗布、脫脂棉、記錄紙筆等)應裝入專用的醫療垃圾袋,密封消毒後集中焚燒。

(四)浸泡防化服、頭盔、解剖器械等用的消毒液,可以直接排入下水道。

十三、屍檢的指標及采用的技術

標本的形態學特征應當按照常規的病理屍體解剖程序進行觀察,包括HE染色、免疫組化染色、電鏡染色以及蛋白質、DNA和RNA分析。除了通過HE染色觀察形態學和病理學變化外,還可通過透射電鏡觀察病毒顆粒;通過各種免疫組織化學染色觀察細胞成分變化;運用探針對病毒結構的特異性探針和特異性抗體進行原位雜交和免疫組化染色,檢測病毒的RNA或DNA、肽或蛋白質的分布情況;結合兩種或多種技術進行雙重、多重標記,或者將不同染色在連續切片上進行,以確定被病毒或任何其他病原體感染的細胞類型;還可運用PCR、RT-PCR、real-time　PCR、NASBA等並結合原位雜交和芯片技術來確定病毒是否存在、病毒數量和分布。對從組織標本中提取的病毒應當進行培養和測序,並與已知的病毒序列進行比對,進而檢測感染病毒可能存在的突變,並根據測序對病毒進行的分類和命名。

十四、數據的保存、分析和報告

凡開展屍檢工作的單位,應對屍體姓名、年齡、性別、發病地、—21—居住地、屍體來曆、臨床診斷、流行病學史、解剖查驗時間、解剖查驗人姓名、解剖步驟、所取組織、解剖查驗後診斷、解剖查驗結果報告日期等有關信息進行完整記錄。屍檢獲取的資料應當進行統計學分析、圖像分析、定量處理,並與GenBank和文獻中的信息進行比對。屍檢工作人員要掌握和了解病例的有關流行病學資料和臨床資料,屍檢初步報告應在10日內完成,完整的報告應在30天內完成。屍檢結果連同有關流行病學資料和臨床資料應及時反饋相應的醫療機構、疾病預防控制機構和衛生行政部門。醫療機構應根據屍檢結果,綜合臨床表現,盡快明確診斷,並按規定報告。屍檢組織由專人進行妥善保管,未經衛生行政部門許可,不得擅自轉移和使用。衛生行政部門應指定相應的屍體解剖查驗機構和疾病預防控制機構對屍檢資料進行整理、分析和保存