豬是甲型流感病毒（IAV）生態學中一個關鍵物種，能夠支持人類、禽類和豬株的複制，從而促進其演化。它們也是2009年H1N1大流行病毒（H1N1pdm09）的來源。了解豬IAV如何突破物種屏障對於檢測潛在的大流行病毒至關重要，但相比禽源IAV，這一問題常被忽視。我們假設，（大流行前）豬病毒的血凝素-神經氨酸酶（HA-NA）平衡是一個關鍵特征，需要進行調整，因為豬與人類在唾液糖組（sialoglycome）方面存在差異。我們重點研究了一組在H1N1pdm09出現後於墨西哥收集的（大流行前）豬病毒。系統進化分析顯示，這一病毒的出現之前，HA和NA中發生了被預測會影響其功能的氨基酸置換。因此，血凝素（HA）獲得了替代突變A227E，此前已顯示可降低H1N1pdm09中受體結合能力，而神經氨酸酶（NA）在第二唾液酸結合位點（2SBS）獲得了替代突變S369N，該突變預計可降低NA裂解活性。通過使用連接到納米顆粒的重組蛋白進行生物層幹涉實驗，確認了這些突變對HA-NA平衡的影響。利用具有豬源HA和NA的重組減毒流感病毒進行工程改造，並分別帶有或不帶上述突變，結果顯示2SBS替代突變對人類和豬原代培養的病毒複制產生負面影響。有趣的是，HA的替代突變能夠恢複病毒的複制能力。總體而言，我們顯示H1N1pdm09在人類中出現之前，HA和NA中發生了在豬體內獲得的替代，並調整了HA-NA平衡。我們假設HA-NA平衡的調整是跨越宿主物種屏障的關鍵步驟。