背景
2024~2026年美國H5N1 2.3.4.4b奶牛疫情主要通過共識水平的系統發育學特征進行描述。是否有哺乳動物適應性變異在感染宿主體內以亞共識頻率出現，特別是在血凝素受體結合位點（RBD），仍然未知，因為尚未對公共測序數據集進行系統的宿主內變異分析。
方法
我們對NCBI序列讀取檔案中所有公開可用的H5N1牛、貓溢出及零售牛奶序列（涵蓋7個生物項目，共4,559個樣本）進行了預注冊的、全語料庫的宿主內單核苷酸變異（iSNV）分析。針對11個位點的Tier 1哺乳動物適應性面板（覆蓋聚合酶複合體、血凝素RBD及輔助蛋白），采用雙調用者一致性流程（iVar與LoFreq）及經實證確定的等位基因頻率（AF）阈值（3%，通過包括合成添加對照在內的四重標准驗證確定）。隨後對各宿主類別的宿主內核苷酸多樣性進行了比較。
結果
HA RBD 位點Q226L和G228S（H3 編號）在超過4,300個充分測序的樣本中，在所有測試的等位頻率阈值（1–5%）下均未檢測到，盡管分析流程在這些確切的密碼子位置上檢測到了其他非同義變異（患病率的上95%置信區間：0.08%）。在經過 Bonferroni 校正（校正後的α=0.00417）後，十一個位點中的七個位點顯示出統計學顯著的iSNV信號，但均為低患病率（≤2.95%）。基因型分層顯示，大多數聚合酶位點的檢測反映了基因型結構，而非宿主體內的出現：PB2 631 L→M 的表觀“逆轉”主要是D1.1基因型的祖先禽源狀態（23個檢測中有20個），該基因型從未獲得 631L 哺乳動物適應性，在B3.13背景下僅有兩個真正的亞共識事件；而共識水平的PB2 701N 是D1.1基因型的固定特征（14個檢測中有10個），而非獨立的亞共識出現。與貓科溢出樣本相比，牛顯示出顯著更高的宿主內核苷酸多樣性（π=1.59×10^-4對6.11×10^-5；Kruskal–Wallis 檢驗 p=6.6×10^-15），在進行測序深度匹配後這一發現仍然存在（p=4.6×10^-5）；這可能反映了乳腺的長期感染，但采樣差異和宿主生物學因素亦不能排除。
結論
我們在美國乳制品H5N1疫情中未檢測到HA受體轉換適應（通過Q226L/G228S獲得人型α2,6受體結合）出現在任何檢測的等位基因頻率中。聚合酶複合體位點存在次共識哺乳動物適應信號，但其流行率低，呈基因型結構分布而非獨立重複出現，並且在用於風險評估前需要功能性表征。