自2024年3月25日在美國奶牛中確認H5N1高致病性禽流感（HPAI）病毒以來，牛高致病性禽流感疫情持續蔓延，截至2026年4月2日，已有19個州報告超過1,000個確診養殖群。為確保持續監測高致病性禽流感的傳播，已評估額外的血清學檢測方法，以補充現有的商業ELISA和支持當前流行病學方法的分子工具。我們先前建立了一種針對N1抗體的神經氨酸酶抑制（NI）-糖蛋白酶聯結合檢測（ELLA）方法，用於DIVA（區分感染與疫苗接種動物）監測，以在接種疫苗的家禽中檢測H5N1感染。在本研究中，我們應用NI-ELLA檢測和量化個體（n=150）及散裝儲奶罐（n=104）牛奶樣本中的N1抗體。我們證明了，根據樣本質量，未處理樣本以及通過離心收集的下清液經熱滅活處理後均可用於不同的血清學檢測。在NI-ELLA與商業ELISA之間的抗體檢測中存在很強的相關性。NI-ELLA測定的終點滴度也與用於評估奶樣保護性抗體水平的病毒中和滴度高度相關。對散裝牛乳樣品中N1抗體的檢測和定量進一步顯示，在病毒分離為陰性的樣本中（無論PCR檢測是否發現病毒RNA），其檢測率和抗體滴度均高於病毒分離為陽性的樣本。較高水平的中和抗體可能有助於在收集乳汁時根據病毒感染階段未檢測到傳染性病毒。未來的研究有必要描述乳汁樣本中抗體反應在較長時間內的持續時間和動態變化，並且NI-ELLA將在這些研究中作為評估抗體反應的寶貴定量工具。