高致病性禽流感A(H5N1)由於其曆史上的高毒性以及逐漸擴展的哺乳動物宿主範圍，構成了全球健康威脅，這一點通過2024~2025年美國奶牛群體中的爆發得到證明，當時有71例人類感染確診。盡管尚未記錄到人傳人病例，但有限的既有人體免疫力以及有關感染人類的進化障礙的不確定性，使H5N1成為潛在的全球性大流行威脅。將H5N1檢測能力擴展到當前有限範圍之外，對於應對潛在疫情至關重要。因此，我們開發並驗證了一種針對流感A陽性樣本池進行H5亞型分型的雙靶點逆轉錄PCR檢測方法。該檢測針對甲型流感A(H5)的血凝素(HA)基因的兩個區域。使用含滅活牛源H5N1病毒的人工樣本，我們確定了檢測對單個樣本的95%下限檢測值為58拷貝/mL（95%置信區間[CI]：50至66拷貝/mL），對八樣本混合池的下限為2,465拷貝/mL（95% CI：1,969至3,756拷貝/mL）。該檢測顯示100%的陽性百分比一致性，在所有人工H5陽性混合池中均檢測出H5（32/32混合池；95% CI：89.1%至100.0%），其中人工陽性樣本的濃度範圍為500,000至3,906拷貝/mL。我們在H5陰性、甲型流感陽性樣本池中觀察到100%的陰性百分比一致性（32/32；95% 置信區間：89.1%至100.0%）。盡管樣本合並降低了分析敏感性，但在八個樣本的樣本池中，含有人類呼吸道感染中通常檢測到的水平的H5病毒的人工樣本仍被檢測到。這種方法有可能在保持適當敏感性的同時，提高甲型流感（H5）的檢測能力，從而增強對潛在爆發的應對准備。