高致病性禽流感 (HPAI) H5N1 傳播到哺乳動物，包括美國乳牛，突顯了對牛奶和環境樣本進行有效監測的必要性。本研究評估了在各種奶類及乳品農場表面中檢測甲型流感病毒 (IAV) 的分子方法。優化了氯化鋁 (AlCl3) 沉澱法以濃縮牛奶中的病毒，並結合基於磁珠的核酸提取和植物 RNA 分離輔助劑。滅活 HPAI H5N1 的平均回收率在巴氏消毒奶中為 22.46 ± 11.86%，在生奶中為 17.22 ± 6.15%。H3N2 的檢測限 (LoD95%) 分別為 2.9 × 10^5 基因組拷貝 (gc)/L（生奶）和 8.13 × 10^4 gc/L（巴氏奶）；H5N1 的檢測限分別為 1.20 × 10^4 gc/L（生奶）和 3.10 × 10^5 gc/L（巴氏奶）。使用丙啶單偶氮（PMAxx?）、鉑（IV）氯化物（PtCl4）和交聯劑（CL）的衣殼完整性RT-qPCR顯示，PtCl4在熱滅活病毒後信號消除效果最佳，但僅在極高溫（99 °C，5 分鍾）下有效。對於表面采樣，基於ISO 15216:1的PBS拭子方法優於海綿法，尤其是在不鏽鋼和矽膠表面。病毒回收率因表面和基質而異。這些結果支持在乳制品環境中HPAI H5N1監測的標准化采樣和濃縮方案。