加拿大發現一例人類感染2.3.4.4b亞型H5N1流感病毒病例，其血凝素（HA）受體結合位點（RBS）存在E190D和Q226H兩種少數變異。鑒於190位和226位突變曾與其它流感亞型受體特異性改變相關，我們探究了其對H5 HA受體結合的影響。通過重組蛋白技術與ELISA基糖苷結合測定法，評估了其與典型禽源及人源唾液酸化糖苷的結合能力。單突變及組合突變均導致檢測到的糖苷結合完全喪失。為驗證該表型是否依賴背景，我們還將Q226H突變引入兩種代表不同譜系的H5 HA蛋白中，兩種情況下突變均同樣消除了受體結合能力。這些發現獨立地驗證了近期聚糖微陣列的觀測結果，並證明患者衍生的E190D和Q226H突變會嚴重損害H5亞型背景下受體結合能力。H5關鍵受體結合域（RBS）位點的單一突變通常破壞而非賦予人源型受體特異性，證實了適應人源型受體所需的複雜突變途徑。