高致病性禽流感（H5N1）近期擴大了宿主範圍，將奶牛納入其中。自2024年3月起，美國已報告超1000例病例。該病毒在奶牛中的傳播及向其他哺乳動物（包括41例已確認的人類病例）的溢出，增加了病毒重組和適應哺乳動物宿主的突變風險。H5N1研究至關重要，但因其高致病性，活病毒操作必須在生物安全三級實驗室進行。處理含病毒材料時需嚴格遵循生物安全規程以確保安全。本報告探討了在生物安全二級（CL2）實驗室實現安全操作的病毒滅活方案，該級別實驗室可提升工作效率。我們測試了β-丙內酯作為H5N1在細胞培養基和蛋液卵黃囊液中的滅活劑。我們還測試了含有95%乙醇的Qiagen Buffer AVL是否可以滅活尿囊液中的病毒。我們報道了0.1%和0.2%的β-丙內酯和乙醇緩沖液AVL成功地完全滅活了細胞培養基和尿囊液中的HPAI。這些滅活方法允許將樣本安全轉移到CL2實驗室，並促進下遊應用，如疫苗檢測、ELISA、qPCR和RNA測序。重要的是，由於高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒的人畜共患潛力及其高致病性特征，在處理含病毒材料時必須采取嚴格的生物安全措施，並且需要在3級封閉實驗室中進行工作。如果與滅活病毒有關的任何下遊工作將在2級封閉實驗室進行，則需要驗證病毒的完全滅活，因為不完全滅活會帶來實驗室獲得性感染和環境釋放的嚴重風險。我們的研究建立並驗證了β-丙內酯和AVL加95%乙醇在尿囊液和組織培養基中完全滅活HPAI H5N1病毒的方案。