2024年，在美國的奶牛中檢測到前所未有的H5N1高致病性禽流感爆發，導致家禽，野生鳥類和包括人類在內的其他哺乳動物受到感染。在這裏，我們提供了分子和病毒學證據，證明牛B3.13基因型H5N1病毒在聚合酶基因中迅速積累了適應性，從而能夠在牛細胞和組織以及包括人類在內的其他哺乳動物的細胞中更好地複制。我們在牛中發現了幾種哺乳動物適應性的證據，包括在所有牛序列中發現的PB2 M631L和在大多數牛中發現的PA K497R。在結構上，PB2 M631L映射到聚合酶-ANP32界面，這是病毒基因組複制的重要宿主因子。我們表明，這種突變使聚合酶能夠更好地與牛ANP32蛋白，特別是ANP32A相互作用，從而增強牛乳腺系統和原代人氣道培養物中的病毒複制。我們表明，PB2基因的持續進化，包括E627K和聚合產生的D740N取代，進一步增加了一系列哺乳動物細胞中的聚合酶活性和病毒複制。因此，H5N1在奶牛中的傳播可以使病毒適應，提高牛的複制能力，並構成持續的人畜共患傳播風險。