高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1分支2.3.4.4b在全球範圍內迅速傳播，多個物種報告了哺乳動物感染。最近哺乳動物間傳播的證據加劇了人們對病毒對哺乳動物潛在適應性的擔憂。聚合酶堿性2（PB2）蛋白E627K突變似乎對哺乳動物的適應至關重要。我們從韓國野鳥中分離出一株高致病性禽流感H5N1分支2.3.4.4b病毒，其PB2第627位氨基酸為96%的E和4%的K。為了研究這個分支在哺乳動物適應方面的基因組特征，我們研究了H5N1病毒在小鼠中的複制和傳播。進行了兩個具有不同挑戰接觸比的實驗，以評估傳播動力學和突變發展。在實驗1中，4:1的挑戰接觸比導致直接接觸小鼠之間100%的傳播，所有小鼠都死於感染。在實驗2中，1:1的比例產生了50%的傳播，所有受攻擊的小鼠也都死亡。在這兩個實驗中，肺部和大腦中都觀察到高病毒載量，病毒滴度隨著時間的推移而增加。值得注意的是，最初在病毒庫中占4%的PB2-E627K變體被選中，在攻擊後6天在肺部和大腦中接近固定（~100%），隨後被傳播。沒有發現其他哺乳動物適應性突變，強調了PB2-E627K在哺乳動物適應性早期階段的關鍵作用。這些發現強調了持續基因組監測的必要性，以檢測哺乳動物的適應標記並評估種間傳播風險。