Imai, M., Ueki, H., Ito, M., Iwatsuki-Horimoto, K.. 高致病性禽H5N1甲型流感病毒在牛乳腺和乳頭組織離體培養物中的複制. Emerging Microbes & Infections
發表人：kickingbird 發表時間：2025年1月10日9点46分 來源：Emerging Microbes & Infections
自2024年初以來，屬於血凝素（HA）分支2.3.4.4b基因型B3.13的高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒一直在美國奶牛中爆發。這些疫情導致受影響奶牛場的牛傳播給包括人類在內的其他哺乳動物。值得注意的是，從人類身上分離出的牛H5N1病毒已被證明可以通過呼吸道飛沫在雪貂之間傳播，對公共衛生構成威脅。
來自受影響奶牛的未經消毒的牛奶已被證明含有高水平的病毒。對自然或實驗感染的奶牛乳腺的病理檢查顯示，肺泡上皮細胞中存在病毒抗原，與肺部相比，乳腺中檢測到更高的病毒RNA載量。這些發現表明，乳腺是高致病性禽流感H5N1病毒複制的主要靶點。盡管Halwe等人表明，禽高致病性禽流感H5N1病毒可以在泌乳奶牛的乳腺中複制，但缺乏將牛H5N1病毒在牛乳腺和乳頭離體複制與從其他物種分離的病毒複制進行比較的研究。在這裏，我們比較了奶牛H5N1、雞H5N1和人類H1N1 2009大流行（H1N1pdm）病毒在泌乳奶牛乳腺和乳頭離體外植體培養中的複制能力和細胞嗜性。我們還檢測了這些器官中的病毒受體表達。
流感病毒感染是通過HA引發的，HA與宿主細胞表面的糖蛋白和糖脂相關的含唾液酸（Sia）的聚糖結合。人流感病毒的HA優先識別以Sia末端通過α2,6-鍵與半乳糖（Gal）連接的聚糖，而禽流感病毒的HAs優先識別以唾液酸末端通過α2,3-鍵與Gal連接的聚糖。因此，我們使用三種不同的凝集素通過免疫熒光染色檢查了哺乳奶牛乳腺的肺泡、小葉間導管和腺池以及乳頭池中的細胞表面Sia（圖S1）：山茱萸凝集素I（MAL-I），對Siaα2,3Galβ1,4GalNAc（N-乙酰氨基葡萄糖）具有特異性；）。乳腺組織表現出MAL-II和SNA與肺泡上皮表面的結合，但MAL-I沒有。在小葉間導管上皮中，SNA與表面結合，但MAL-I沒有。這些發現與之前的研究結果一致。然而，與早期的一項研究[9]的結果不同，MAL-II顯示與小葉間導管上皮表面結合。這種差異的原因尚不清楚；然而，這可能是由於凝集素和/或實驗環境的差異（例如，來自不同供應商的MAL在人類氣道中具有不同的結合模式）。在腺體和乳頭池上皮的表面檢測到SNA結合，而MAL-II沒有與這些組織結合。MAL-I偶爾與乳頭池上皮表面結合，染色強度較弱，但未能與腺池上皮結合。當組織切片用Arthrobacter ureafaciens唾液酸酶（切割所有非還原性末端分支和非分支的Sia）預處理時，凝集素與組織的結合大大減少（圖S2），證實了凝集素的Sia結合特異性。總之，這些結果表明，人型受體廣泛分布在乳腺內的肺泡、導管和腺池上皮以及奶牛的乳頭池上皮中，而禽型受體分布在肺泡、導管、乳頭池上皮上。
接下來，我們評估了A/奶牛/Texas/24-008749-001/2024（H5N1；Cow-H5N1）和A/雞/AVL-76321VIR7050-39/2021（H5N1；chicken-H5N1。盡管一些高致病性禽流感H5N1病毒在PB2聚合酶亞基中具有E627K或D701N置換，這增加了禽流感病毒在哺乳動物中的複制，但這兩種H5N1病毒在PB 2中不編碼E627K和D701N。為了進行比較，我們還納入了A/Isumi/UT-K001-01/2018（H1N1pdm），這是一種目前在人類中傳播的甲型流感病毒株。感染後24小時（hpi），Cow-H5N1在肺泡、腺體和乳頭池中複制[平均滴度分別為4.3、5.3和7.2 log10（PFU/g）]，滴度明顯高於雞-H5N1[平均滴度各自為2.5、3.5和6.0 log10（PFD/g）]和H1N1pdm[平均滴度各為1.7、2.4和1.8 log10（PWU/g），見圖1A）。在48小時時，乳頭池中Cow-H5N1的病毒滴度[平均滴度=7.8 log10（PFU/g）]明顯高於H1N1pdm[平均滴度=3.0 log10（PFD/g）]。然而，在牛和雞的H5N1病毒之間沒有發現病毒滴度的顯著差異。我們還觀察到，在24 hpi時，感染Cow-H5N1的肺泡和乳頭池中的培養上清液中的病毒滴度明顯高於感染Chicken-H5N1或H1N1pdm的肺泡和奶頭池中的病毒效價（圖S3）。宿主細胞蛋白酶對HA的切割激活是病毒感染周期中的關鍵步驟。高致病性禽流感H5N1病毒的HA含有一個被無處不在的蛋白酶切割的多堿基切割位點，而人類流感病毒的HA則含有一個僅被胰蛋白酶樣蛋白酶切割的單堿基切割位點。我們發現，在含有外源胰蛋白酶的培養基中，牛和雞的H5N1複制滴度高於H1N1pdm，但兩種H5N1病毒之間沒有顯著差異（圖S4）。這一結果表明，即使當H1N1pdm的HA蛋白被胰蛋白酶激活時，H1N1pdm的複制也僅限於牛乳腺和乳頭。免疫組織化學染色在感染Cow-H5N1、Chicken-H5N1或H1N1pdm病毒的肺泡中未檢測到病毒抗原（圖1B）。組織學顯示，在24和48 hpi時，模擬感染組織中的肺泡結構坍塌（圖S5）。牛乳腺退化發生在斷奶後，其特征是肺泡上皮細胞凋亡[15]。或者，所使用的培養基可能不適合牛乳腺肺泡上皮細胞培養。因此，我們無法評估肺泡上皮細胞中的病毒複制。然而，在牛和雞H5N1病毒感染組織的腺池和乳頭池上皮中檢測到強烈的病毒抗原染色（圖1B）。感染H1N1pdm後，乳頭池上皮細胞而非腺池上皮細胞呈病毒抗原陽性。總的來說，這些結果表明，在奶牛的腺池和乳頭池上皮中，Cow-H5N1病毒的複制效率高於雞-H5N1或人H1N1pdm病毒。
來自受影響奶牛的未經消毒的牛奶已被證明含有高水平的病毒。對自然或實驗感染的奶牛乳腺的病理檢查顯示，肺泡上皮細胞中存在病毒抗原，與肺部相比，乳腺中檢測到更高的病毒RNA載量。這些發現表明，乳腺是高致病性禽流感H5N1病毒複制的主要靶點。盡管Halwe等人表明，禽高致病性禽流感H5N1病毒可以在泌乳奶牛的乳腺中複制，但缺乏將牛H5N1病毒在牛乳腺和乳頭離體複制與從其他物種分離的病毒複制進行比較的研究。在這裏，我們比較了奶牛H5N1、雞H5N1和人類H1N1 2009大流行（H1N1pdm）病毒在泌乳奶牛乳腺和乳頭離體外植體培養中的複制能力和細胞嗜性。我們還檢測了這些器官中的病毒受體表達。
流感病毒感染是通過HA引發的，HA與宿主細胞表面的糖蛋白和糖脂相關的含唾液酸（Sia）的聚糖結合。人流感病毒的HA優先識別以Sia末端通過α2,6-鍵與半乳糖（Gal）連接的聚糖，而禽流感病毒的HAs優先識別以唾液酸末端通過α2,3-鍵與Gal連接的聚糖。因此，我們使用三種不同的凝集素通過免疫熒光染色檢查了哺乳奶牛乳腺的肺泡、小葉間導管和腺池以及乳頭池中的細胞表面Sia（圖S1）：山茱萸凝集素I（MAL-I），對Siaα2,3Galβ1,4GalNAc（N-乙酰氨基葡萄糖）具有特異性；）。乳腺組織表現出MAL-II和SNA與肺泡上皮表面的結合，但MAL-I沒有。在小葉間導管上皮中，SNA與表面結合，但MAL-I沒有。這些發現與之前的研究結果一致。然而，與早期的一項研究[9]的結果不同，MAL-II顯示與小葉間導管上皮表面結合。這種差異的原因尚不清楚；然而，這可能是由於凝集素和/或實驗環境的差異（例如，來自不同供應商的MAL在人類氣道中具有不同的結合模式）。在腺體和乳頭池上皮的表面檢測到SNA結合，而MAL-II沒有與這些組織結合。MAL-I偶爾與乳頭池上皮表面結合，染色強度較弱，但未能與腺池上皮結合。當組織切片用Arthrobacter ureafaciens唾液酸酶（切割所有非還原性末端分支和非分支的Sia）預處理時，凝集素與組織的結合大大減少（圖S2），證實了凝集素的Sia結合特異性。總之，這些結果表明，人型受體廣泛分布在乳腺內的肺泡、導管和腺池上皮以及奶牛的乳頭池上皮中，而禽型受體分布在肺泡、導管、乳頭池上皮上。
接下來，我們評估了A/奶牛/Texas/24-008749-001/2024（H5N1；Cow-H5N1）和A/雞/AVL-76321VIR7050-39/2021（H5N1；chicken-H5N1。盡管一些高致病性禽流感H5N1病毒在PB2聚合酶亞基中具有E627K或D701N置換，這增加了禽流感病毒在哺乳動物中的複制，但這兩種H5N1病毒在PB 2中不編碼E627K和D701N。為了進行比較，我們還納入了A/Isumi/UT-K001-01/2018（H1N1pdm），這是一種目前在人類中傳播的甲型流感病毒株。感染後24小時（hpi），Cow-H5N1在肺泡、腺體和乳頭池中複制[平均滴度分別為4.3、5.3和7.2 log10（PFU/g）]，滴度明顯高於雞-H5N1[平均滴度各自為2.5、3.5和6.0 log10（PFD/g）]和H1N1pdm[平均滴度各為1.7、2.4和1.8 log10（PWU/g），見圖1A）。在48小時時，乳頭池中Cow-H5N1的病毒滴度[平均滴度=7.8 log10（PFU/g）]明顯高於H1N1pdm[平均滴度=3.0 log10（PFD/g）]。然而，在牛和雞的H5N1病毒之間沒有發現病毒滴度的顯著差異。我們還觀察到，在24 hpi時，感染Cow-H5N1的肺泡和乳頭池中的培養上清液中的病毒滴度明顯高於感染Chicken-H5N1或H1N1pdm的肺泡和奶頭池中的病毒效價（圖S3）。宿主細胞蛋白酶對HA的切割激活是病毒感染周期中的關鍵步驟。高致病性禽流感H5N1病毒的HA含有一個被無處不在的蛋白酶切割的多堿基切割位點，而人類流感病毒的HA則含有一個僅被胰蛋白酶樣蛋白酶切割的單堿基切割位點。我們發現，在含有外源胰蛋白酶的培養基中，牛和雞的H5N1複制滴度高於H1N1pdm，但兩種H5N1病毒之間沒有顯著差異（圖S4）。這一結果表明，即使當H1N1pdm的HA蛋白被胰蛋白酶激活時，H1N1pdm的複制也僅限於牛乳腺和乳頭。免疫組織化學染色在感染Cow-H5N1、Chicken-H5N1或H1N1pdm病毒的肺泡中未檢測到病毒抗原（圖1B）。組織學顯示，在24和48 hpi時，模擬感染組織中的肺泡結構坍塌（圖S5）。牛乳腺退化發生在斷奶後，其特征是肺泡上皮細胞凋亡[15]。或者，所使用的培養基可能不適合牛乳腺肺泡上皮細胞培養。因此，我們無法評估肺泡上皮細胞中的病毒複制。然而，在牛和雞H5N1病毒感染組織的腺池和乳頭池上皮中檢測到強烈的病毒抗原染色（圖1B）。感染H1N1pdm後，乳頭池上皮細胞而非腺池上皮細胞呈病毒抗原陽性。總的來說，這些結果表明，在奶牛的腺池和乳頭池上皮中，Cow-H5N1病毒的複制效率高於雞-H5N1或人H1N1pdm病毒。
相關鏈結：
