甲型流感病毒（H3N2）在全球范围内流行并引起呼吸道疾病。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的美国疾病预防控制中心（CDC）人流感病毒实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）甲型流感病毒（H3/H1pdm09）亚型鉴定检测用于季节性甲型流感病毒的亚型分类。然而，H3反向引物区域出现的新兴突变引发了人们对该检测对当前流行病毒敏感性降低的担忧。我们通过重新设计反向引物以靶向血凝素基因中更具保守性的区域，并对正向引物和探针进行微调，对H3检测进行了更新。采用培养的流感病毒、合成RNA和非流感呼吸道病原体组合进行了分析灵敏度、包容性和排他性评估。临床性能则通过季节性A（H3N2）残留呼吸道标本进行评估。更新后的检测方法（H3_v2）展现出与初始H3检测相当或更优的分析灵敏度，检测限约为10 1.7–10 2.1 EID50/mL，每反应含5份RNA。对于在反向引物中存在A21G与T23G、T23C或T23A双错配的病毒，观察到性能提升，初始H3与H3_v2检测方法间Ct值存在可测量的偏移。该检测方法在139份临床样本中与预期结果完全一致，且对其他流感亚型或呼吸道病原体无交叉反应。这些结果表明，更新后的H3_v2检测方法在保持高特异性的同时，提高了对当前及新兴季节性A(H3N2)病毒的灵敏度。这一更新确保了对季节性A（H3N2）的持续可靠检测，包括基因漂移的A（H3N1）病毒，如最近出现的A（A3N2）亚型K病毒，并支持全球流感监测和诊断准备。准确检测和分型甲型流感（H3N2）病毒对于临床诊断、疫情应对和全球流感监测至关重要。在FDA批准的CDC A（H3）实时RT-PCR检测中，导致引物错配的突变的出现和固定引发了人们对当代循环A（H3N2）病毒敏感性降低的担忧。为了解决这个问题，我们重新设计了反向引物并优化了其他检测组件，以提高对目前流行的季节性甲型（H3N2）病毒的检测。更新的H3_v2检测方法恢复并提高了灵敏度，包括对携带关键反向引物错配的病毒，同时保持了高特异性和与临床标本的完全一致性。这一更新确保了对季节性甲型流感病毒（H3N2）和甲型流感病毒变异株（包括最近出现的甲型H3N2亚型K病毒）的可靠检测，并加强了国家和国际的诊断准备和监测能力。