近期，美国奶牛群中检测到高致病性禽流感A（H5N1）病毒（HPAI H5N1），该病毒属于2.3.4.4b谱系，源于禽类宿主的多次溢出传播事件。2025年12月，通过国家乳制品检测策略，在威斯康星州一处奶牛场发现HPAI H5N1病毒。本文报道了从该场关联的批量牛奶中分离出的一株2.3.4.4b谱系D1.1基因型H5N1病毒——A/奶牛/威斯康星/25G05743-001/2025（WI5743-H5N1），阐述了其系统发育关系，并评估了其在小鼠体内的致病性。通过盲传至鸡胚卵中成功回收到感染性病毒。系统发育分析显示，WI5743-H5N1与此前报道的内华达州和亚利桑那州奶牛群中D1.1谱系病毒存在显着差异，支持其为独立传入奶牛群，且可能源于本地禽类宿主。与亲缘关系密切的禽类病毒相比，WI5743-H5N1编码了适应哺乳动物的PB2-E627K替换，以及在血凝素（HA）、PB1-F2和核衣壳蛋白（NS1）中的其他氨基酸差异。在小鼠体内，WI5743-H5N1能在呼吸道组织中高效复制，并可在大脑中检测到，但与其他近期的2.3.4.4b谱系B3.13型病毒相比，其致死性较低。这些发现共同凸显了感染奶牛的高致病性禽流感H5N1病毒在遗传和表型上的多样性，并强调了持续监测新兴毒株及进行功能表征的重要性。