2025年2月，康奈尔动物健康诊断中心（AHDC；美国纽约伊萨卡）的病毒学实验室收到了大量胎牛血清（FBS），用于常规外源性因子检测，根据《联邦法规第9编》（9CFR）动物源生物制品的要求（§113.53, §113.46, §113.47）。检测的FBS由5个州（宾夕法尼亚州、堪萨斯州、内布拉斯加州、南卡罗来纳州和加利福尼亚州）收集的样品组成。我们按照9CFR的规定对样品进行了测试，通过在T75细胞培养瓶中，将Vero细胞（ATCC CCL-81）和AHDC病毒学实验室开发的原代胎牛肾（FBK）细胞接种在含2%青霉素/链霉素和15%（最终浓度）的测试FBS样品的Eagle最小必需培养基中。我们将细胞维持7天，并监测细胞病理变化。FBK细胞未显示出病毒性细胞病变（CPE），但通过病毒特异性免疫荧光检测显示非细胞毒性的牛病毒性腹泻病毒呈阳性。我们在接种后第7天观察到Vero细胞出现CPE。随后对Vero细胞进行的IFA检测中，对9CFR列出的牛病毒（即牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、蓝舌病病毒、呼肠孤病毒、牛腺病毒、牛呼吸道合胞病毒和狂犬病毒）均呈阴性。我们还按照9CFR规定，用含15%对照伽玛照射FBS培养的FBK和Vero细胞进行了检测；这些细胞仍然没有表现出CPE，而且IFA病毒检测也是阴性。
我们对从表现出细胞病变效应（CPE）的Vero细胞获得的上清液进行了病毒宏基因组测序，先是进行了序列无关的单引物扩增（SISPA）核酸和文库制备，使用了连接测序gDNA试剂盒（SQK-LSK109）和原生条码试剂盒96（Oxford Nanopore Technologies, https://www.nanoporetech.com）。我们在GridION平台上的MinION流动池进行测序（两者均为Oxford Nanopore Technologies产品）。总共有13,599条测序读被分类为H5N1亚型禽流感A病毒。生物信息学分析确认该病毒属于H5N1 2.3.4.4b分支B3.13基因型（GISAID登录号 EPI4889248–55）。对拼接的基因片段序列进行系统发育分析显示，FBS H5N1分离株序列聚类在B3.13基因型内部，并与2024年12月加利福尼亚收集的奶牛样本关系密切。我们通过逆转录实时荧光PCR（rRT-PCR）确认了在该分离株中存在甲型禽流感病毒。由于在这个样本中检测到了H5N1病毒，我们停止了对原始样本的偶然病毒检测。

我们进行了额外的检测，包括使用rRT-PCR以及在细胞培养和受精鸡蛋(ECE)中进行病毒分离，针对同一批FBS，使用8个新提交的100毫升未热灭活样品和5个100毫升热灭活样品（56°C, 30分钟），以调查并确认高致病性H5N1亚型禽流感病毒的存在。我们使用国家动物卫生实验室网络的禽流感A病毒矩阵rRT-PCR方案检测了所有13个FBS样品，结果在1个未热灭活样品（046093-25-4，循环阈值[Ct] 37.7）和1个热灭活样品（046093-25-9，Ct 39.1）中检测到了病毒RNA。为了在细胞培养中分离病毒，我们再次遵循了9CFR规定的检测方法，并在T75培养瓶中接种了Vero细胞和牛子宫上皮细胞（CAL-1，已知对H5N1病毒敏感）。我们在15%胎牛血清（FBS）存在下培养细胞，并维持它们7天后进行下一次传代，总共进行了3次传代（共21天）。我们每天监测细胞的细胞病变效应（CPE）。其中一个未进行热灭活的FBS样品（046093-25-2）在Vero细胞中显示出CPE（图2），我们通过使用M基因特异性rRT-PCR确认了流感A病毒的分离。
为了提高病毒分离的灵敏度，我们还用了ECE病毒分离法测试了FBS样本。我们把15毫升原始样本放在蔗糖垫（10 × NTC缓冲液：1 M NaCl，0.2 M Tris-HCL pH 7.4，50 mM CaCl2；蔗糖30% [质量/体积]）中进行超高速离心（32,000 rpm，1小时30分钟），然后把沉淀重悬在1毫升1×磷酸盐缓冲液中。我们用0.3毫升未稀释和稀释的（10:1和10:2，磷酸盐缓冲液）原始样本以及0.1毫升超高速离心后的FBS样本接种到10天大的ECE鸡胚（每种条件3个鸡蛋）。我们每天观察胚胎存活情况，持续5天。5天后，我们收集绒毛液，用rRT-PCR和血凝试验检测禽流感A病毒，然后再把它们接种到ECE里进行第二轮传代。我们从两份未热灭活的超高速离心FBS样本中分离出了病毒。样品046093-25-6在10?1稀释度下呈阳性，所以我们进行了超速离心。我们通过基质rRT-PCR和血凝试验确认了流感病毒的分离。其中一个样品（046093-25-7）在首次在鸡胚卵黄囊培养后，10?1稀释度下血凝试验为阴性，但尿囊液通过基质rRT-PCR检测呈阳性（Ct 31）。
在美国农业部动物与植物健康检查局国家兽医服务实验室（爱荷华州埃姆斯）尝试确认病毒分离没有成功。即使使用rRT-PCR检测，这批测试的胎牛血清中高致病性H5N1病毒的检测频率也很低，而且没有检测到病毒，这表明这批混合胎牛血清中的病毒载量很低（可能低于每毫升1个感染性颗粒）。
根据我们的研究结果，以及对受感染泌乳乳牛血病毒血症的怀疑，我们对在加利福尼亚（n = 384）和德克萨斯（n = 384）屠宰场收集的个体胎牛血清样本进行了进一步测试。在这些样本中，有1个通过禽流感A病毒基质rRT-PCR检测呈阳性（Ct 35）。胎牛血清中的这一发现支持了这样一个假设：偶发的高致病性禽流感（HPAI）血病毒血症能够使病毒到达不同组织，包括在罕见情况下到达胎儿。来自奶牛场的报告表明，感染H5N1的处女牛在HPAI H5N1病毒感染后曾经历生殖问题，包括流产。
接下来，我们评估了热灭活血清对高致病性禽流感病毒的效率。将血清（1毫升分装，加入约7 log10 50% 组织培养感染力剂量/毫升的病毒）在56°C下处理30分钟，就能使病毒失活。
结论
胎牛血清（FBS）是细胞培养基中最常用的生长补充剂。虽然在FBS中发现人畜共患病毒会引发对牛血清诊断检测及其他使用FBS的实验室操作（如细胞培养）的生物安全担忧，但对FBS进行热处理似乎能有效灭活病毒，可作为一种潜在的安全防护措施。