面对高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1谱系2.3.4.4b在鸟类中的出现及其在奶牛中的传播，全球诊断实验室亟需快速可靠的检测方法来识别人类感染HPAIV的情况。我们改进并评估了一种分子型甲型流感亚型检测方法，该方法基于高通量全自动平台，可检测A(H1N1)pdm09、A(H3N2)、A(H5)及泛型甲型流感靶标。针对靶标包容性/排他性，我们对既往发表的靶标引物和探针（Panning等、Terrier等及世界卫生组织）进行了修改，并适配为罗氏cobas5800/6800/8800系统的多重反应。为评估新型亚型分型检测的分析性能，采用外部质量评估（EQA）样本作为标准并采用数字PCR进行定量。通过95%概率单位分析确定的检测限分别为：A(H1N1)pdm09亚型754.0数字拷贝（dcp）/毫升，A(H3N2)亚型148.0 dcp/毫升，A(H5)亚型156 dcp/毫升，以及流感A全靶标45.2 dcp/毫升。针对每个亚型分型靶标，至少评估了四个对数阶的线性关系（决定系数r2：0.9969–0.9998）。该检测与EQA样本、德国弗里德里希·洛夫勒研究所（Friedrich Loeffler Institut）的洗脱液以及采用132份临床样本进行的CE-IVD手工检测均显示100%一致性。在专一性样本集中未检测到假阳性结果。本新型亚型分型检测完全自动化、易于扩展，适用于监测和常规临床环境，可实现人类高致病性禽流感病毒感染的检测，并有助于在早期阶段阻断潜在传播链。