高致病性H5N1禽流感病毒在哺乳动物间的持续传播正重塑这些病原体的宿主范围。其中最长持续的哺乳动物传播链涉及2024年初在美国乳牛中发现的B3.13基因型。基因组分析显示血凝素突变D104G和V147M的正向选择与快速固定。通过糖组学分析，我们证实牛组织（包括乳腺）富含以N-糖基神经氨酸酸（NeuGc）封顶的N-和O-连接聚糖，而NeuGc是人类和鸟类中缺失的唾液酸，它们仅表达N-乙酰神经氨酸酸（NeuAc）。早期牛H5病毒很难识别NeuGc，但D104G和V147M能够有效地结合含NeuAc和NeuGc的受体。这些突变增强了牛乳腺组织中的复制，而没有显着减弱人肺和原代鼻上皮细胞中的复制。因此，NeuGc驱动的受体适应促进了牛的病毒适应性，同时可能限制了直接的人畜共患风险。深度突变扫描进一步确定了赋予NeuGc使用的替代血凝素替代品，并代表了新兴牛H5谱系的监测标志。