高致病性禽流感（H5N1）近期扩大了宿主范围，将奶牛纳入其中。自2024年3月起，美国已报告超1000例病例。该病毒在奶牛中的传播及向其他哺乳动物（包括41例已确认的人类病例）的溢出，增加了病毒重组和适应哺乳动物宿主的突变风险。H5N1研究至关重要，但因其高致病性，活病毒操作必须在生物安全三级实验室进行。处理含病毒材料时需严格遵循生物安全规程以确保安全。本报告探讨了在生物安全二级（CL2）实验室实现安全操作的病毒灭活方案，该级别实验室可提升工作效率。我们测试了β-丙内酯作为H5N1在细胞培养基和蛋液卵黄囊液中的灭活剂。我们还测试了含有95%乙醇的Qiagen Buffer AVL是否可以灭活尿囊液中的病毒。我们报道了0.1%和0.2%的β-丙内酯和乙醇缓冲液AVL成功地完全灭活了细胞培养基和尿囊液中的HPAI。这些灭活方法允许将样本安全转移到CL2实验室，并促进下游应用，如疫苗检测、ELISA、qPCR和RNA测序。重要的是，由于高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒的人畜共患潜力及其高致病性特征，在处理含病毒材料时必须采取严格的生物安全措施，并且需要在3级封闭实验室中进行工作。如果与灭活病毒有关的任何下游工作将在2级封闭实验室进行，则需要验证病毒的完全灭活，因为不完全灭活会带来实验室获得性感染和环境释放的严重风险。我们的研究建立并验证了β-丙内酯和AVL加95%乙醇在尿囊液和组织培养基中完全灭活HPAI H5N1病毒的方案。