2024年，在美国的奶牛中检测到前所未有的H5N1高致病性禽流感爆发，导致家禽，野生鸟类和包括人类在内的其他哺乳动物受到感染。在这里，我们提供了分子和病毒学证据，证明牛B3.13基因型H5N1病毒在聚合酶基因中迅速积累了适应性，从而能够在牛细胞和组织以及包括人类在内的其他哺乳动物的细胞中更好地复制。我们在牛中发现了几种哺乳动物适应性的证据，包括在所有牛序列中发现的PB2 M631L和在大多数牛中发现的PA K497R。在结构上，PB2 M631L映射到聚合酶-ANP32界面，这是病毒基因组复制的重要宿主因子。我们表明，这种突变使聚合酶能够更好地与牛ANP32蛋白，特别是ANP32A相互作用，从而增强牛乳腺系统和原代人气道培养物中的病毒复制。我们表明，PB2基因的持续进化，包括E627K和聚合产生的D740N取代，进一步增加了一系列哺乳动物细胞中的聚合酶活性和病毒复制。因此，H5N1在奶牛中的传播可以使病毒适应，提高牛的复制能力，并构成持续的人畜共患传播风险。