在分子诊断和病原体测序时代，高致病性禽流感A病毒（IAV）入侵美国奶牛是前所未有的。这引发了人们对进一步爆发的可能性以及奶牛是否可以成为新型IAV毒株的混合容器的质疑。使用一组BSL2安全重组病毒，代表自2020年以来流行的H5流行谱系2.3.4.4b分支，我们发现，与早期的EA-2020-C基因型病毒相比，牛B3.13分离株在牛乳腺细胞中的复制增强，病毒聚合酶活性增加，牛细胞中的干扰素拮抗作用更强。然而，多种鸟类和哺乳动物的IAV毒株，包括其他2.3.4.4b分支的高致病性基因型，在牛细胞中具有复制能力，特别是乳腺细胞，这表明存在一个多样化的循环IAV库，有可能感染奶牛。此外，我们发现奶牛乳腺细胞共表达α-2,3和α-2,6连接的唾液酸，并且容易与人类和鸟类IAV共感染。我们得出结论，美国奶牛流感爆发不仅仅反映了B3.13基因型病毒的独特适应；相反，牛乳房代表了IAV的一个允许性生态位和一个可能的重组位点，突显了它在产生具有大流行风险的新型流感病毒方面的潜在作用。