H9N2禽流感病毒（AIV）在全球家禽中流行，并越来越具有人畜共患性。尽管灭活疫苗长期广泛使用，但H9N2禽流感病毒在鸡群中仍占主导地位。我们证明灭活疫苗不能阻止接种疫苗的鸡的上呼吸道中H9N2 AIV的复制。接种疫苗的鸡在连续传代过程中病毒传播增强，这归因于缺陷干扰颗粒的产生受到限制，以及引入了稳定的突变（NP-N417D、M1-V219I和NS1-R140W），从而增强了病毒复制。值得注意的是，H9N2禽流感病毒的遗传多样性更大，在通过接种疫苗的鸡而不是通过幼稚鸡传播后，包括更多潜在的哺乳动物/人类适应性突变，这可能有助于哺乳动物适应性毒株的出现。相比之下，在上呼吸道诱导细胞/粘膜免疫的疫苗有效地限制了H9N2 AIV。这些发现突显了灭活疫苗的局限性，以及需要修订疫苗接种策略来控制H9N2 AIV。