2024年3月25日，美国首次报道了奶牛中高致病性禽流感病毒（HPAIV）H5N1的多州爆发，标志着首次在牛中发现HPAIV H5N1。不久之后，受影响奶牛场的一名奶制品工人成为与此次疫情直接相关的首例人类病例。对甲型流感病毒（IAV）的研究需要二级方法来检测感染细胞或感染动物模型中的病毒。我们修改了人类A/Texas/37/2024（HPhTX）H5N1病毒的非结构（NS）基因组片段，以创建表达纳米萤光素酶的重组病毒（HPhTX-NSs-Nluc），从而能够通过体外、离体和体内成像系统（IVIS）追踪培养细胞和小鼠中的病毒。在体外，HPhTX-NSs-Nluc显示出与其野生型（WT）对应物相似的生长和斑块特征。在体内，HPhTX NSs Nluc允许分别使用体内和体外IVIS追踪整个动物和受感染动物器官中的病毒感染。重要的是，HPhTX NSs Nluc的发病率、死亡率和复制滴度与野生型HPhTX相当。在体外，Baloxavir酸（BXA）将HPhTX NSs Nluc抑制到WT HPhTX观察到的水平。我们还证明了使用HPhTX-NSs-Nluc评估BXA体内抗病毒活性的可行性。我们的研究结果支持，HPhTX NSs Nluc是追踪病毒感染的优秀工具，包括确定治疗导致奶牛爆发的高致病性禽流感H5N1的预防或治疗方法。