Imai, M., Ueki, H., Ito, M., Iwatsuki-Horimoto, K.. 高致病性禽H5N1甲型流感病毒在牛乳腺和乳头组织离体培养物中的复制. Emerging Microbes & Infections
发表人：kickingbird 发表时间：2025年1月10日9点46分 来源：Emerging Microbes & Infections
自2024年初以来，属于血凝素（HA）分支2.3.4.4b基因型B3.13的高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒一直在美国奶牛中爆发。这些疫情导致受影响奶牛场的牛传播给包括人类在内的其他哺乳动物。值得注意的是，从人类身上分离出的牛H5N1病毒已被证明可以通过呼吸道飞沫在雪貂之间传播，对公共卫生构成威胁。
来自受影响奶牛的未经消毒的牛奶已被证明含有高水平的病毒。对自然或实验感染的奶牛乳腺的病理检查显示，肺泡上皮细胞中存在病毒抗原，与肺部相比，乳腺中检测到更高的病毒RNA载量。这些发现表明，乳腺是高致病性禽流感H5N1病毒复制的主要靶点。尽管Halwe等人表明，禽高致病性禽流感H5N1病毒可以在泌乳奶牛的乳腺中复制，但缺乏将牛H5N1病毒在牛乳腺和乳头离体复制与从其他物种分离的病毒复制进行比较的研究。在这里，我们比较了奶牛H5N1、鸡H5N1和人类H1N1 2009大流行（H1N1pdm）病毒在泌乳奶牛乳腺和乳头离体外植体培养中的复制能力和细胞嗜性。我们还检测了这些器官中的病毒受体表达。
流感病毒感染是通过HA引发的，HA与宿主细胞表面的糖蛋白和糖脂相关的含唾液酸（Sia）的聚糖结合。人流感病毒的HA优先识别以Sia末端通过α2,6-键与半乳糖（Gal）连接的聚糖，而禽流感病毒的HAs优先识别以唾液酸末端通过α2,3-键与Gal连接的聚糖。因此，我们使用三种不同的凝集素通过免疫荧光染色检查了哺乳奶牛乳腺的肺泡、小叶间导管和腺池以及乳头池中的细胞表面Sia（图S1）：山茱萸凝集素I（MAL-I），对Siaα2,3Galβ1,4GalNAc（N-乙酰氨基葡萄糖）具有特异性；）。乳腺组织表现出MAL-II和SNA与肺泡上皮表面的结合，但MAL-I没有。在小叶间导管上皮中，SNA与表面结合，但MAL-I没有。这些发现与之前的研究结果一致。然而，与早期的一项研究[9]的结果不同，MAL-II显示与小叶间导管上皮表面结合。这种差异的原因尚不清楚；然而，这可能是由于凝集素和/或实验环境的差异（例如，来自不同供应商的MAL在人类气道中具有不同的结合模式）。在腺体和乳头池上皮的表面检测到SNA结合，而MAL-II没有与这些组织结合。MAL-I偶尔与乳头池上皮表面结合，染色强度较弱，但未能与腺池上皮结合。当组织切片用Arthrobacter ureafaciens唾液酸酶（切割所有非还原性末端分支和非分支的Sia）预处理时，凝集素与组织的结合大大减少（图S2），证实了凝集素的Sia结合特异性。总之，这些结果表明，人型受体广泛分布在乳腺内的肺泡、导管和腺池上皮以及奶牛的乳头池上皮中，而禽型受体分布在肺泡、导管、乳头池上皮上。
接下来，我们评估了A/奶牛/Texas/24-008749-001/2024（H5N1；Cow-H5N1）和A/鸡/AVL-76321VIR7050-39/2021（H5N1；chicken-H5N1。尽管一些高致病性禽流感H5N1病毒在PB2聚合酶亚基中具有E627K或D701N置换，这增加了禽流感病毒在哺乳动物中的复制，但这两种H5N1病毒在PB 2中不编码E627K和D701N。为了进行比较，我们还纳入了A/Isumi/UT-K001-01/2018（H1N1pdm），这是一种目前在人类中传播的甲型流感病毒株。感染后24小时（hpi），Cow-H5N1在肺泡、腺体和乳头池中复制[平均滴度分别为4.3、5.3和7.2 log10（PFU/g）]，滴度明显高于鸡-H5N1[平均滴度各自为2.5、3.5和6.0 log10（PFD/g）]和H1N1pdm[平均滴度各为1.7、2.4和1.8 log10（PWU/g），见图1A）。在48小时时，乳头池中Cow-H5N1的病毒滴度[平均滴度=7.8 log10（PFU/g）]明显高于H1N1pdm[平均滴度=3.0 log10（PFD/g）]。然而，在牛和鸡的H5N1病毒之间没有发现病毒滴度的显着差异。我们还观察到，在24 hpi时，感染Cow-H5N1的肺泡和乳头池中的培养上清液中的病毒滴度明显高于感染Chicken-H5N1或H1N1pdm的肺泡和奶头池中的病毒效价（图S3）。宿主细胞蛋白酶对HA的切割激活是病毒感染周期中的关键步骤。高致病性禽流感H5N1病毒的HA含有一个被无处不在的蛋白酶切割的多碱基切割位点，而人类流感病毒的HA则含有一个仅被胰蛋白酶样蛋白酶切割的单碱基切割位点。我们发现，在含有外源胰蛋白酶的培养基中，牛和鸡的H5N1复制滴度高于H1N1pdm，但两种H5N1病毒之间没有显着差异（图S4）。这一结果表明，即使当H1N1pdm的HA蛋白被胰蛋白酶激活时，H1N1pdm的复制也仅限于牛乳腺和乳头。免疫组织化学染色在感染Cow-H5N1、Chicken-H5N1或H1N1pdm病毒的肺泡中未检测到病毒抗原（图1B）。组织学显示，在24和48 hpi时，模拟感染组织中的肺泡结构坍塌（图S5）。牛乳腺退化发生在断奶后，其特征是肺泡上皮细胞凋亡[15]。或者，所使用的培养基可能不适合牛乳腺肺泡上皮细胞培养。因此，我们无法评估肺泡上皮细胞中的病毒复制。然而，在牛和鸡H5N1病毒感染组织的腺池和乳头池上皮中检测到强烈的病毒抗原染色（图1B）。感染H1N1pdm后，乳头池上皮细胞而非腺池上皮细胞呈病毒抗原阳性。总的来说，这些结果表明，在奶牛的腺池和乳头池上皮中，Cow-H5N1病毒的复制效率高于鸡-H5N1或人H1N1pdm病毒。
来自受影响奶牛的未经消毒的牛奶已被证明含有高水平的病毒。对自然或实验感染的奶牛乳腺的病理检查显示，肺泡上皮细胞中存在病毒抗原，与肺部相比，乳腺中检测到更高的病毒RNA载量。这些发现表明，乳腺是高致病性禽流感H5N1病毒复制的主要靶点。尽管Halwe等人表明，禽高致病性禽流感H5N1病毒可以在泌乳奶牛的乳腺中复制，但缺乏将牛H5N1病毒在牛乳腺和乳头离体复制与从其他物种分离的病毒复制进行比较的研究。在这里，我们比较了奶牛H5N1、鸡H5N1和人类H1N1 2009大流行（H1N1pdm）病毒在泌乳奶牛乳腺和乳头离体外植体培养中的复制能力和细胞嗜性。我们还检测了这些器官中的病毒受体表达。
流感病毒感染是通过HA引发的，HA与宿主细胞表面的糖蛋白和糖脂相关的含唾液酸（Sia）的聚糖结合。人流感病毒的HA优先识别以Sia末端通过α2,6-键与半乳糖（Gal）连接的聚糖，而禽流感病毒的HAs优先识别以唾液酸末端通过α2,3-键与Gal连接的聚糖。因此，我们使用三种不同的凝集素通过免疫荧光染色检查了哺乳奶牛乳腺的肺泡、小叶间导管和腺池以及乳头池中的细胞表面Sia（图S1）：山茱萸凝集素I（MAL-I），对Siaα2,3Galβ1,4GalNAc（N-乙酰氨基葡萄糖）具有特异性；）。乳腺组织表现出MAL-II和SNA与肺泡上皮表面的结合，但MAL-I没有。在小叶间导管上皮中，SNA与表面结合，但MAL-I没有。这些发现与之前的研究结果一致。然而，与早期的一项研究[9]的结果不同，MAL-II显示与小叶间导管上皮表面结合。这种差异的原因尚不清楚；然而，这可能是由于凝集素和/或实验环境的差异（例如，来自不同供应商的MAL在人类气道中具有不同的结合模式）。在腺体和乳头池上皮的表面检测到SNA结合，而MAL-II没有与这些组织结合。MAL-I偶尔与乳头池上皮表面结合，染色强度较弱，但未能与腺池上皮结合。当组织切片用Arthrobacter ureafaciens唾液酸酶（切割所有非还原性末端分支和非分支的Sia）预处理时，凝集素与组织的结合大大减少（图S2），证实了凝集素的Sia结合特异性。总之，这些结果表明，人型受体广泛分布在乳腺内的肺泡、导管和腺池上皮以及奶牛的乳头池上皮中，而禽型受体分布在肺泡、导管、乳头池上皮上。
接下来，我们评估了A/奶牛/Texas/24-008749-001/2024（H5N1；Cow-H5N1）和A/鸡/AVL-76321VIR7050-39/2021（H5N1；chicken-H5N1。尽管一些高致病性禽流感H5N1病毒在PB2聚合酶亚基中具有E627K或D701N置换，这增加了禽流感病毒在哺乳动物中的复制，但这两种H5N1病毒在PB 2中不编码E627K和D701N。为了进行比较，我们还纳入了A/Isumi/UT-K001-01/2018（H1N1pdm），这是一种目前在人类中传播的甲型流感病毒株。感染后24小时（hpi），Cow-H5N1在肺泡、腺体和乳头池中复制[平均滴度分别为4.3、5.3和7.2 log10（PFU/g）]，滴度明显高于鸡-H5N1[平均滴度各自为2.5、3.5和6.0 log10（PFD/g）]和H1N1pdm[平均滴度各为1.7、2.4和1.8 log10（PWU/g），见图1A）。在48小时时，乳头池中Cow-H5N1的病毒滴度[平均滴度=7.8 log10（PFU/g）]明显高于H1N1pdm[平均滴度=3.0 log10（PFD/g）]。然而，在牛和鸡的H5N1病毒之间没有发现病毒滴度的显着差异。我们还观察到，在24 hpi时，感染Cow-H5N1的肺泡和乳头池中的培养上清液中的病毒滴度明显高于感染Chicken-H5N1或H1N1pdm的肺泡和奶头池中的病毒效价（图S3）。宿主细胞蛋白酶对HA的切割激活是病毒感染周期中的关键步骤。高致病性禽流感H5N1病毒的HA含有一个被无处不在的蛋白酶切割的多碱基切割位点，而人类流感病毒的HA则含有一个仅被胰蛋白酶样蛋白酶切割的单碱基切割位点。我们发现，在含有外源胰蛋白酶的培养基中，牛和鸡的H5N1复制滴度高于H1N1pdm，但两种H5N1病毒之间没有显着差异（图S4）。这一结果表明，即使当H1N1pdm的HA蛋白被胰蛋白酶激活时，H1N1pdm的复制也仅限于牛乳腺和乳头。免疫组织化学染色在感染Cow-H5N1、Chicken-H5N1或H1N1pdm病毒的肺泡中未检测到病毒抗原（图1B）。组织学显示，在24和48 hpi时，模拟感染组织中的肺泡结构坍塌（图S5）。牛乳腺退化发生在断奶后，其特征是肺泡上皮细胞凋亡[15]。或者，所使用的培养基可能不适合牛乳腺肺泡上皮细胞培养。因此，我们无法评估肺泡上皮细胞中的病毒复制。然而，在牛和鸡H5N1病毒感染组织的腺池和乳头池上皮中检测到强烈的病毒抗原染色（图1B）。感染H1N1pdm后，乳头池上皮细胞而非腺池上皮细胞呈病毒抗原阳性。总的来说，这些结果表明，在奶牛的腺池和乳头池上皮中，Cow-H5N1病毒的复制效率高于鸡-H5N1或人H1N1pdm病毒。
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