高致病性禽流感H5N1毒株在美国奶牛中引发了多州疫情，自发病以来已在15个州蔓延，感染了数百个奶牛群。我们迅速开发并优化了基于PCR的检测方法和测序方案，以支持H5N1分子监测。我们使用来自20个州的214种零售牛奶进行方法开发，发现数字PCR的H5N1浓度与qPCR循环阈值（Ct）值密切相关，dPCR表现出更高的敏感性。我们还发现，杂交选择后的宏基因组测序最适合高浓度样本，而扩增子测序最适合低浓度样本。通过建立这些方法，我们能够支持创建一个覆盖马萨诸塞州的监测计划，每月对马萨诸塞州所有奶牛场的散装牛奶样本进行检测，这些样本迄今为止仍为阴性。这里描述的方法、工作流程和建议为其他旨在进行H5N1监测工作的人提供了一个框架。