甲型流感病毒（H3N2）在全球範圍內流行並引起呼吸道疾病。美國食品藥品監督管理局（FDA）批准的美國疾病預防控制中心（CDC）人流感病毒實時逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）甲型流感病毒（H3/H1pdm09）亞型鑒定檢測用於季節性甲型流感病毒的亞型分類。然而，H3反向引物區域出現的新興突變引發了人們對該檢測對當前流行病毒敏感性降低的擔憂。我們通過重新設計反向引物以靶向血凝素基因中更具保守性的區域，並對正向引物和探針進行微調，對H3檢測進行了更新。采用培養的流感病毒、合成RNA和非流感呼吸道病原體組合進行了分析靈敏度、包容性和排他性評估。臨床性能則通過季節性A（H3N2）殘留呼吸道標本進行評估。更新後的檢測方法（H3_v2）展現出與初始H3檢測相當或更優的分析靈敏度，檢測限約為10 1.7–10 2.1 EID50/mL，每反應含5份RNA。對於在反向引物中存在A21G與T23G、T23C或T23A雙錯配的病毒，觀察到性能提升，初始H3與H3_v2檢測方法間Ct值存在可測量的偏移。該檢測方法在139份臨床樣本中與預期結果完全一致，且對其他流感亞型或呼吸道病原體無交叉反應。這些結果表明，更新後的H3_v2檢測方法在保持高特異性的同時，提高了對當前及新興季節性A(H3N2)病毒的靈敏度。這一更新確保了對季節性A（H3N2）的持續可靠檢測，包括基因漂移的A（H3N1）病毒，如最近出現的A（A3N2）亞型K病毒，並支持全球流感監測和診斷准備。准確檢測和分型甲型流感（H3N2）病毒對於臨床診斷、疫情應對和全球流感監測至關重要。在FDA批准的CDC A（H3）實時RT-PCR檢測中，導致引物錯配的突變的出現和固定引發了人們對當代循環A（H3N2）病毒敏感性降低的擔憂。為了解決這個問題，我們重新設計了反向引物並優化了其他檢測組件，以提高對目前流行的季節性甲型（H3N2）病毒的檢測。更新的H3_v2檢測方法恢複並提高了靈敏度，包括對攜帶關鍵反向引物錯配的病毒，同時保持了高特異性和與臨床標本的完全一致性。這一更新確保了對季節性甲型流感病毒（H3N2）和甲型流感病毒變異株（包括最近出現的甲型H3N2亞型K病毒）的可靠檢測，並加強了國家和國際的診斷准備和監測能力。