高致病性禽流感 (HPAI) H5N1 传播到哺乳动物，包括美国乳牛，突显了对牛奶和环境样本进行有效监测的必要性。本研究评估了在各种奶类及乳品农场表面中检测甲型流感病毒 (IAV) 的分子方法。优化了氯化铝 (AlCl3) 沉淀法以浓缩牛奶中的病毒，并结合基于磁珠的核酸提取和植物 RNA 分离辅助剂。灭活 HPAI H5N1 的平均回收率在巴氏消毒奶中为 22.46 ± 11.86%，在生奶中为 17.22 ± 6.15%。H3N2 的检测限 (LoD95%) 分别为 2.9 × 10^5 基因组拷贝 (gc)/L（生奶）和 8.13 × 10^4 gc/L（巴氏奶）；H5N1 的检测限分别为 1.20 × 10^4 gc/L（生奶）和 3.10 × 10^5 gc/L（巴氏奶）。使用丙啶单偶氮（PMAxx?）、铂（IV）氯化物（PtCl4）和交联剂（CL）的衣壳完整性RT-qPCR显示，PtCl4在热灭活病毒后信号消除效果最佳，但仅在极高温（99 °C，5 分钟）下有效。对于表面采样，基于ISO 15216:1的PBS拭子方法优于海绵法，尤其是在不锈钢和硅胶表面。病毒回收率因表面和基质而异。这些结果支持在乳制品环境中HPAI H5N1监测的标准化采样和浓缩方案。