甲型流感病毒神经氨酸酶（NA）在病毒生命周期中起核心作用，是研究唾液酸识别和水解及其对病毒摄取、嗜性和致病性影响的关键靶点。在此，我们报道了基于2,3-二氟唾液酸的NA活性探针的设计、合成及评估。该探针携带一个C4-氨基取代基，以促进活性位点结合并通过酪氨酸-唾液酸中间体稳定共价捕获。C5叠氮乙酰胺基手柄可通过CuAAC进行生物正交标记以便检测，而预先点击的生物素变体则支持一步标记。我们合成了叠氮基和生物素两种形式，并评估了它们对重组甲型流感NA的抑制活性。复活实验显示，相较于相关的2,3-二氟类似物，其恢复时间延长到小时级，尽管C5修饰降低了NA亲和性和共价半衰期，与4-氨基-2,3-二氟-Neu5Ac相比。在标记实验中，这些探针标记了多种重组病毒神经氨酸酶和病毒样品中存在的NA。此外，9-叠氮-2,3-二氟-Neu5Ac及其生物素预先偶联的对应物被证明是对NA具有高效活性的小分子探针。这四种探针共同为进一步开发用于细胞分析、病毒NA活性检测和诊断的分子工具提供了先导结构。