加拿大发现一例人类感染2.3.4.4b亚型H5N1流感病毒病例，其血凝素（HA）受体结合位点（RBS）存在E190D和Q226H两种少数变异。鉴于190位和226位突变曾与其它流感亚型受体特异性改变相关，我们探究了其对H5 HA受体结合的影响。通过重组蛋白技术与ELISA基糖苷结合测定法，评估了其与典型禽源及人源唾液酸化糖苷的结合能力。单突变及组合突变均导致检测到的糖苷结合完全丧失。为验证该表型是否依赖背景，我们还将Q226H突变引入两种代表不同谱系的H5 HA蛋白中，两种情况下突变均同样消除了受体结合能力。这些发现独立地验证了近期聚糖微阵列的观测结果，并证明患者衍生的E190D和Q226H突变会严重损害H5亚型背景下受体结合能力。H5关键受体结合域（RBS）位点的单一突变通常破坏而非赋予人源型受体特异性，证实了适应人源型受体所需的复杂突变途径。