了解美国食品药品监督管理局批准的抗病毒药物对包括奶牛在内的围产期物种中传播的甲型H5N1流感病毒的可靠性对于公共卫生和疫情前规划至关重要，但由于甲型H5N1流感的严重程度，无法在临床上进行建模。在小鼠中，我们证明，在用A（H5N1）污染的牛奶进行致命攻击（口服、鼻内、眼部）后，巴洛西韦治疗比奥司他韦介导更大的疾病结果（存活率、病毒传播）。


高致病性禽流感（HPAI）A（H5N1）HA分支2.3.4.4b病毒于2021年在北美出现，并在野生鸟类、陆生中食肉动物和水生哺乳动物中检测到。人畜共患传染病已导致13例人类病例。最近在14个州的208个奶牛群中发现了A（H5N1），这代表了病毒进化的额外风险。存在多种潜在的人类接触途径，包括呼吸道和眼部（挤奶或清洁过程中的气溶胶/飞溅）以及口腔（食用受污染的生牛奶）。职业接触受感染的奶牛已导致4例确诊的人类感染，导致结膜炎和/或轻度呼吸道症状。所有患者均接受神经氨酸酶抑制剂（NAI）磷酸奥司他韦（达菲）治疗。2.3.4.4b支系禽病毒的基线奥司他韦羧酸盐（OSE）50%抑制浓度（IC50）比季节性A（H1N1）pdm09参考文献高15倍。目前尚不清楚这是否表明OSE疗效实际降低，或者是否需要为该亚型提供新的基线比较值。因此，了解多途径接触受A（H5N1）污染的牛奶后现有流感抗病毒药物的体内活性变得具有重大的公共卫生意义。
在这里，我们测试了美国食品药品监督管理局批准的抗病毒药物OSE和帽依赖性内切酶抑制剂巴洛西韦（Xofluza），这些药物是在用从感染A（H5N1）的奶牛身上收集的牛奶对小鼠进行口服、鼻内或眼部接种（以模拟人类接触的潜在途径）后使用的。确定每种途径的50%小鼠致死剂量（MLD50），并用于提供致死挑战剂量（图S1）。24小时后开始药物治疗。给药OSE（口服，20mg/kg/天，5天，BID）以模拟人类给药方案和/或临床前小鼠研究。给予BXA（5mg/kg，1剂，皮下注射），以提供与临床前动物研究相似的PK/PD和消除半衰期值。由于高致病性禽流感感染的严重性，还包括每种药物的高剂量（OSE 200mg/kg，BXA 25mg/kg）。未经药物治疗的动物作为阴性对照。在临床疾病高峰附近测定了多种组织中的病毒滴度（图S2）。
所有经口接种、未经治疗的动物均死于感染，平均死亡时间（MTTD）为4.0天。除胃外，在所有采集的器官中均检测到病毒（≥3.1 log10TCID50/mL）。OSE提供了13-25%的存活率（图1A）。比较了药物治疗动物和未治疗动物的器官滴度的统计学意义。只有高剂量OSE降低了任何器官滴度（仅鼻甲[NT]，P≤0.01）（图1D）。BXA治疗提供了0-25%的生存率（图1A）。然而，两种BXA剂量都降低了血液、眼睛、NT和肠道中的病毒滴度（P≤0.01），而高剂量BXA也降低了肺部滴度（P<0.01）（图1C）。
所有经鼻内接种、未经治疗的动物均死于感染（MTTD 5.0天），所有器官中均检测到病毒（2.2-7.6 log10TCID50/mL）。低剂量OSE动物没有存活，而高剂量提供了40%的存活率（图1D）。低剂量OSE降低了血液滴度（P≤0.01），而高剂量OSE还降低了肠道滴度（P≥0.01）（图1E）。BXA治疗提供了50-75%的存活率，并降低了所有组织中的病毒滴度（P≤0.05）（图1F）。
所有经眼部接种、未经治疗的动物均死于感染（MTTD 8.5天），除胃外，所有器官中均检测到病毒（≥1.1-6.1 log10TCID50/mL）。OSE治疗提供了25-63%的生存率（图1G）。两种OSE剂量都降低了脑和肺中的病毒滴度（P≤0.0001），并且观察到具有眼部滴度的动物数量减少的趋势。高剂量OSE还降低了NT和肠道滴度（P≤0.0001）（图1H）。两种BXA剂量都提供了100%的保护，并降低了包括眼睛在内的所有组织滴度（P≤0.05）（图1I）。
接下来，我们测试了我们的接种物对BXA和OSE的表型敏感性，并将结果与美国疾病控制和预防中心报告的禽A（H5N1）2.3.4.4b IC50中值进行了比较。我们牛奶接种物中存在的病毒的BXA IC50为0.41 nM，与a（H5N1）2.3.4.4b中位数或a（H1N1）pdm09参考相比，变化≤1.4倍，表明抑制正常。OSE IC50为2.24 nM，与a（H5N1）2.3.4.4b中位数相比，敏感性变化≤1.5倍，但与季节性a（H1N1）pdm09参考（表1）相比，降低了13倍，在表明药物抑制降低的范围内，可能对我们的结果有所贡献。由于相关已发表研究的数量较少，这些NAI IC50值与治疗结果的相关性仍然存在一些挑战。重要的是，禽A（H5N1）2.3.4.4b其他NAI（扎那米韦和帕拉米韦）的IC50值与季节性参考值没有显着差异，表明OSE具有特异性作用。

这些增加的OSE IC50值的临床相关性尚未完全清楚，将我们的数据外推到临床护理需要谨慎。在动物模型中，尚未在人类中观察到与2.3.4.4b病毒相关的神经病理学。我们不能排除呼吸道外传播导致我们观察到的高死亡率。然而，无法进行人类A（H5N1）临床试验意味着动物建模和相关治疗干预目前是开始了解体外易感性和体内疗效之间关系的唯一选择。虽然我们的数据表明，口服接种HPAI病毒污染的牛奶很难用任何一种药物治疗，但BXA与OSE相比，鼻内和眼部接种后的疾病结果普遍更好。除了OSE等NAI外，考虑BXA用于治疗严重感染和/或为大流行准备储存可能很重要。鉴于BXA的抵抗力屏障较低，可能需要对患者脱落进行监测，最好是进行序列分析。与巴洛昔韦、OSE或经批准的核苷类似物（如莫诺匹韦）的联合治疗可能是降低治疗引起的耐药性和改善临床HPAI结果的有用策略。延长OSE剂量也可能与A（H5N1）感染有关，因为在接受8天OSE治疗的A（H5N1的）攻击小鼠中观察到显着的存活结果和组织滴度降低，而只有5只。测试这些策略在很大程度上仍然依赖于临床前动物建模。迫切需要对禽和牛高致病性禽流感病毒A（H5N1）进行额外的单一疗法和联合疗法研究。在小鼠和其他流感动物模型（如雪貂）中进行这些研究可能会提供关键数据，以便在局部爆发或大流行期间指导这些抗病毒药物的临床实施。